Графен как основа биологических сенсоров для определения маркеров нейродегенеративной деменции

Цель исследования. Отработка методики иммобилизации к поверхности графена антител белков, играющих значимую роль в патогенезе болезни Альцгеймера.
Материалы и методы. Методом сублимации поверхности подложек SiС получали графеновые пленки. Наличие монослоя графена подтверждали по спектрам при спектроскопии. Выполнялась оценка качества поверхности графена методом циклической вольтамперометрии. Далее проводили функционализацию аминогруппами методом, основанным на сорбции из раствора производных пирена и фенилнитрогруппами электрохимическим методом. Образцы графена выдерживали в растворах моноклональных антител к бета-амилоидному пептиду человека 1–42. Также препараты выдерживали в растворе вторичных антител, меченых ФИТЦ. Оценку результатов проводили с помощью флуоресцентной микроскопии. Дополнительно образцы выдерживали в растворе антител с пероксидазной меткой, которую выявляли при проведении хемилюминесценции.
Результаты. Для прикрепления специфических антител к поверхности графена большое значение имеет качество его поверхности. Оптимальной рабочей концентрацией антител к бета-амилоиду человека 1–42 в растворе для последующего изготовления биологических сенсоров является 15 мкг/мл. Ковалентная сшивка антител глутаровым альдегидом с аминогруппами на графене дает незначительный выигрыш в уровне флюоресценции по сравнению с нековалентной сорбцией на графене с нитрогруппами. Функционализация фенилнитрогруппами оптимальна для дальнейшей работы, связанной с выявлением специфических антигенов.
Заключение. Исследована методика иммобилизации на поверхности графена специфических антител к бета-амилоиду в концентрациях, выявляемых флуоресцентной микроскопией и хемилюминесценцией. На графене иммобилизуется количество антител, достаточное для создания биосенсора. Установлено, что функционализация фенилнитрогруппами позволяет создать оптимальные условия для прикрепления антител к поверхности графена, а также производить отмывку образующихся антител-антигенных комплексов для дальнейшего повторного использования графеновых биосенсоров.

1. Scheltens P., Blennow K., Breteler M. M., et al. Alzheimer's disease. Lancet. 2016. Vol. 388, No. 10043. P. 505–517. https://doi.org/10.1016/s0140–6736(15)01124–1

2. GBD 2016 Dementia Collaborators. Global, regional, and national burden of Alzheimer's disease and other dementias, 1990–2016: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet Neurol. 2019. Vol. 18, No. 1. P. 88–106. https://doi.org/10.1016/s1474–4422(18)30403–4

3. Niu H., Álvarez-Álvarez I., Guillén-Grima F., Aguinaga-Ontoso I. Prevalence and incidence of Alzheimer's disease in Europe: A meta-analysis. Prevalencia e incidencia de la enfermedad de Alzheimer en Europa: Metaanálisis. Neurologia. 2017. Vol. 32, No. 8. P. 523–532. https://doi.org/10.1016/j.nrl.2016.02.016

4. United Nations Department of Economic and Social Affairs, Population Division World Population Ageing 2020 Highlights: Living Arrangements of Older Persons. [(accessed on 4 April 2021)]. 2020 (ST/ESA/SER.A/451).

5. US Burden of Disease Collaborators, Mokdad A. H., Ballestros K., et al. The State of US Health, 1990–2016: Burden of Diseases, Injuries, and Risk Factors Among US States. JAMA. 2018. Vol. 319, No. 14. P. 1444–1472. https://doi.org/10.1001/jama.2018.0158

6. Salloway S., Sperling R., Fox N. C., et al. Two phase 3 trials of bapineuzumab in mild-to-moderate Alzheimer's disease. N. Engl. J. Med. 2014. Vol. 370, No. 4. P. 322–333. https://doi.org/10.1056/nejmoa1304839

7. Dubois B., Feldman H. H., Jacova C., et al. Advancing research diagnostic criteria for Alzheimer's disease: the IWG‑2 criteria. Lancet Neurol. 2014. Vol. 13, No. 6. P. 614–629. https://doi.org/10.1016/S 1474–4422(14)70090–0

8. Jack C. R. Jr, Bennett D. A., Blennow K., et al. NIAAA Research Framework: Toward a biological definition of Alzheimer's disease. Alzheimers Dement. 2018. Vol. 14, No. 4. P. 535–562. https://doi.org/10.1016/j.jalz.2018.02.018

9. Hampel H., Lista S., Khachaturian Z. S. Development of biomarkers to chart all Alzheimer's disease stages: The royal road to cutting the therapeutic Gordian Knot. Alzheimers Dement. 2012. Vol. 8, No. 4. P. 312–336. https://doi.org/10.1016/j.jalz.2012.05.2116

10. Blennow K., Hampel H. CSF markers for incipient Alzheimer's disease. Lancet Neurol. 2003. Vol. 2, No. 10. P. 605–613. https://doi.org/10.1016/s1474–4422(03)00530–1

11. Seppälä T. T., Nerg O., Koivisto A. M., et al. CSF biomarkers for Alzheimer disease correlate with cortical brain biopsy findings. Neurology. 2012. Vol. 78, No. 20. P. 1568–1575. https://doi.org/10.1212/wnl.0b013e3182563bd0

12. Portelius E., Hansson S. F., Tran A. J., et al. Characterization of tau in cerebrospinal fluid using mass spectrometry. J. Proteome Res. 2008. Vol. 7, No. 5. P. 2114–2120. https://doi.org/10.1021/pr7008669

13. Blennow K., Dubois B., Fagan A. M., et al. Clinical utility of cerebrospinal fluid biomarkers in the diagnosis of early Alzheimer's disease. Alzheimers Dement. 2015. Vol. 11, No. 1. P. 58–69. https://doi.org/10.1016/j.jalz.2014.02.004

14. Suárez-Calvet M., Karikari T. K., Ashton N. J., et al. Novel tau biomarkers phosphorylated at T181, T217 or T231 rise in the initial stages of the preclinical Alzheimer's continuum when only subtle changes in Aβ pathology are detected. EMBO Mol Med. 2020. Vol. 12, No. 12. P. 12921. https://doi.org/10.15252/emmm.202012921

15. Khalil M., Teunissen C. E., Otto M., et al. Neurofilaments as biomarkers in neurological disorders. Nat Rev Neurol. 2018. Vol. 14 No. 10. P. 577–589. https://doi.org/10.1038/s41582–018–0058-z

16. Preische O., Schultz S. A., Apel A., et al. Serum neurofilament dynamics predicts neurodegeneration and clinical progression in presymptomatic Alzheimer's disease. Nat Med. 2019. Vol. 25, No. 2. P. 277–283. https://doi.org/10.1038/s41591–018–0304–3

17. Mattsson N., Cullen N. C., Andreasson U., et al. Association Between Longitudinal Plasma Neurofilament Light and Neurodegeneration in Patients with Alzheimer Disease. JAMA Neurol. 2019. Vol. 76, No. 7. P. 791–799. https://doi.org/10.1001/jamaneurol.2019.0765

18. Quiroz Y. T., Zetterberg H., Reiman E. M., et al. Plasma neurofilament light chain in the presenilin 1 E 280A autosomal dominant Alzheimer's disease kindred: A cross-sectional and longitudinal cohort study. Lancet Neurol. 2020. Vol. 19, No. 6. P. 513–521. https://doi.org/10.1016/s1474–4422(20)30137-x

19. Duits F. H., Martinez-Lage P., Paquet C., et al. Performance and complications of lumbar puncture in memory clinics: Results of the multicenter lumbar puncture feasibility study. Alzheimers Dement. 2016. Vol. 12, No. 2. P. 154–163. https://doi.org/10.1016/j.jalz.2015.08.003

20. Palmqvist S., Janelidze S., Stomrud E., et al. Performance of Fully Automated Plasma Assays as Screening Tests for Alzheimer Disease-Related β-Amyloid Status. JAMA Neurol. 2019. Vol. 76, No. 9. P. 1060–1069. https://doi.org/10.1001/jamaneurol.2019.1632

21. Schindler S. E., Bollinger J. G., Ovod V., et al. High-precision plasma β-amyloid 42/40 predicts current and future brain amyloidosis. Neurology. 2019. Vol. 93, No. 17. P. 1647–e1659. https://doi.org/10.1212/wnl.0000000000008081

22. Demeritte T., Nellore B. P., Kanchanapally R., et al. Hybrid Graphene Oxide Based Plasmonic-Magnetic Multifunctional Nanoplatform for Selective Separation and Label-Free Identification of Alzheimer's Disease Biomarkers. ACS Appl Mater Interfaces. 2015. Vol. 7, No. 24. P. 13693–13700. https://doi.org/10.1021/acsami.5b03619

23. Sun L., Zhong Y., Gui J., et al. A hydrogel biosensor for high selective and sensitive detection of amyloid-beta oligomers. Int. J. Nanomedicine. 2018. Vol. 13. P. 843–856. https://doi.org/10.2147/ijn.s152163

24. Лебедев А. А., Лебедев С. П., Новиков С. Н., и др. Сверхчувствительный газовый сенсор на основе графена. Журнал технической физики. 2016. Т. 86, вып. 3. С. 135. https://doi.org/10.1134/s1063784216030130

25. Давыдов В. Ю., Усачев Д. Ю., Лебедев С. П. и др. Исследование кристаллической и электронной структуры графеновых пленок, выращенных на 6H-SiC (0001). Физика и техника полупроводников. 2017. Т. 51, вып. 8. С. 1116–1124. https://doi.org/10.21883/ftp.2017.08.44800.8559

26. Torrente-Rodríguez R.M., Lukas H., Tu J., et al. SARS-CoV‑2 RapidPlex: A Graphene-Based Multiplexed Telemedicine Platform for Rapid and Low-Cost COVID‑19 Diagnosis and Monitoring. Matter. 2020. Vol. 3, No. 6. P. 1981–1998. https://doi.org/10.1016/j.matt.2020.09.027

27. Plekhanov A. Yu. Immunoreplica from the gel surface: Rapid and sensitive blot plus intact gel. Analytical Biochemistry. 1996. Vol. 239, No. 1. P. 110–111. https://doi.org/10.1006/abio.1996.0298

28. Усиков A. С., Лебедев С. П., Роенков А. Д. и др. Исследование чувствительной способности графена для применений в качестве биосенсоров. Письма в Журнал технической физики. 2020. Т. 46, № 10. С. 3–6. https://doi.org/10.21883/pjtf.2020.10.49421.18250

29. Плеханов А. Ю., Пузык М. В., Усиков А. С. и др. Хемилюминесценция функционализированной поверхности графена. Оптика и спектроскопия. 2022. Т. 130, № 9. С. 1417–1422. https://doi.org/10.21883/os.2022.09.53305.3628–22